家蚕核型多角体病毒lef-11与宿主相互作用项目申请书

家蚕核型多角体病毒lef-11与宿主相互作用项目申请书 本文关键词：家蚕，核型，宿主，相互作用，申请书

家蚕核型多角体病毒lef-11与宿主相互作用项目申请书 本文简介：西南大学基本科研业务费专项资金项目计划任务书资助类别：学生项目项目名称：家蚕核型多角体病毒lef-11与宿主相互作用研究申请者：董战旗单位：家蚕基因组生物学国家重点实验室联系电话：18883252030起止年月：2015年1月至2015年12月填报日期：2014年9月12日西南大学科学技术处制201

家蚕核型多角体病毒lef-11与宿主相互作用项目申请书 本文内容：

西南大学基本科研业务费

专项资金项目

计划任务书

资助类别：

学生项目

项目名称：

家蚕核型多角体病毒lef-11与宿主相互作用研究

申

请

者：

董战旗

单

位：

家蚕基因组生物学国家重点实验室

联系电话：

18883252030

起止年月：

2015年

1

月

至

2015年

12月

填报日期：

2014年

9月

12

日

西南大学科学技术处制

2014.9

2

西南大学基本科研业务费专项资金项目计划任务书（学生项目）——基本信息

基本信息

申

请

者

信

息

姓名

董战旗

性别

男

出生年月

1989-12

学位

学士

职称

博士生

研究领域

家蚕病理学

电话

023-68250076

手机

18883252030

Email

[email protected]

单位

家蚕基因组生物学国家重点实验室

项目

基本

信息

项目名称

家蚕核型多角体病毒lef-11与宿主相互作用用蛋白研究

学科及代码

昆虫病毒学

1805460

国民行业代码

0390

科技活动

类型

起止时间

2015年1月

至2015年12

月

申请金额

1

万元

项目摘要

项目研究意义(限100字)

家蚕是鳞翅目模式昆虫，由BmNPV引起的脓病是危害蚕桑产业的最大病害。先前对该病毒的研究主要集中于病毒基因组复制表达机制等方面，迫切需要解析BmNPV利用宿主增殖的分子机制，为脓病的有效防控提供支撑。

主要研究内容(限200字)

1、

LEF-11细胞定位研究

通过免疫荧光技术鉴定家蚕核型多角体病毒LEF-11蛋白定位在细胞中的定位位置。

2、

LEF-11蛋白免疫共沉淀研究

通过过表达LEF-11,利用免疫共沉淀，通过质谱分析，筛选相互作用蛋白。

3、

LEF-11相互作用蛋白鉴定。

通过免疫荧光验证LEF-11与相互作用蛋白的共定位，同时通过免疫共沉淀验证相互作用蛋白。

预期目标和成果

A

A.

以第一作者发表、我校为第一署名单位，被国际三大检索（SCI、EI和ISTP）系统收录的学术论文1篇、或A1类刊物论文1篇

关键词（最多5个，用分号隔开）

家蚕；

BmNPV；

LEF-11；免疫共沉淀

西南大学基本科研业务费专项资金项目计划任务书（学生项目）——项目组成员信息

项目组主要成员

编号

姓名

出生年月

性别

职称

学位

所在单位

联系电话

项目分工

每年工作时间（月）

签字

1

潘敏慧

1969-08

男

教授

博士

家蚕基因组生物学国家重点实验室

18523382171

文章撰写

10

2

董战旗

1989-12

男

博士生

学士

家蚕基因组生物学国家重点实验室

18883252030

质谱分析

10

3

胡楠

1993-06

男

硕士生

学士

家蚕基因组生物学国家重点实验室

18883243756

免疫共沉淀

10

4

陈婷婷

1991-09

女

硕士生

学士

家蚕基因组生物学国家重点实验室

15826472203

载体构建

10

5

6

7

8

总人数

高级

中级

初级

博士后

博士生

硕士生

4

1

1

2

3

西南大学基本科研业务费专项资金项目计划任务书（一般项目）——经费预算

项目经费预算

预算编制说明：

在填报本表之前，请认真阅读本年度中央高校基本业务费专项申请的相关通知和文件的相关内容，各科目预算具体内容见《西南大学科研经费管理规定》。

预算支出内容

资金用途

金额

（万元）

计算根据及理由

设备费（不支持购买大型设备）

0

材料费

测试化验加工费

差旅费

会议费（指西南大学主办）

出版/文献/信息传播/知识产权事务费

劳务费

专家咨询费

合

计

15

西南大学基本科研业务费专项资金项目计划任务书（学生项目）

报告正文

一、立项依据与研究内容：

1、项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）

1.1研究意义

家蚕是重要的经济昆虫，家蚕核型多角体病毒（BmNPV）引起家蚕脓病，每年给蚕桑业造成巨大经济损失，目前尚无有效的治疗措施，其主要原因是病毒侵染宿主的作用机制不明确[1]。目前关于杆状病毒的研究主要集中于病毒基因功能的研究，对于杆状病毒与宿主相互作用机制研究较少，尤其是对杆状病毒利用宿主完成自身复制的研究。本课题通过研究lef-11基因与宿主相互作用蛋白研究，初步揭示BmNPV病毒侵染增值的分子机制，对进一步深化研究病毒宿主相互作用提空理论研究具有重要意义。

1.2国内外研究现状及分析

BmNPV是杆状病毒科的成员之一，能产生两种不同类型的病毒粒子一种包埋性病毒（ODV）和芽生型病毒（BV）[2]。由于其基因组只有130kb左右，编码150个氨基酸左右病毒通常需要通过与宿主之间的相互作用来帮助病毒完成复制等过程[3]。

先前Rollie

J.

Clem课题组证实杆状病毒晚期表达因子LEF-7可以抑制宿主细胞H2AX蛋白磷酸化，劫持宿主细胞的DDR反应，最终调控病毒大规模复制[4]。同时在BmNPV中鉴定IE2同时与八个宿主蛋白相互作用，帮助病毒完成复制[5]。

与其他病毒感染宿主一样，BmNPV感染宿主细胞后会通过与宿主细胞相互作用以破坏宿主细胞的防御体系，劫持宿主细胞进程以调控病毒自身的复制增殖。作为杆状病毒晚期表达因子（late

expression

factors，LEFs）家族是参与病毒DNA复制和病毒基因转录调控的一个十分重要的家族。其中，LEF-11是杆状病毒编码的一个13KDa的小分子蛋白[6]。先前对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）的lef-11研究表明，其对病毒DNA复制、病毒基因的转录和病毒的增殖都有影响[7]。我们小组先前对LEF-11核定位进行研究表明其定位于宿主细胞复制中心，说明LEF-11很有可能参与病毒感染宿主细胞后的DNA复制[8]。同时我们过表达lef-11基因鉴定其定位与DNA复制中心。

鉴于此，本项目拟以鉴定家蚕核型多角体病毒LEF-11蛋白与宿主相互作用蛋白为研究对象，采用生物信息学和分子生物学等手段，鉴定LEF-11核定位，通过免疫共沉淀技术筛选并鉴定与LEF-11相互作用蛋白，最用验证与LEF-11相互作用的宿主蛋白。通过该研究可完善BmNPV侵染增殖的分子机制，为抗病育种奠定基础。

参考文献：

1.Blissard,G.W.,Baculovirus--insect

cell

interactions.

Cytotechnology,1996.

20(1-3):

p.

73-93.

2.Hefferon,K.L.,Baculovirus

late

expression

factors.

J

Mol

Microbiol

Biotechnol,2004.

7(3):

p.

89-101.

3.Gomi,S.,K.

Majima,and

S.

Maeda,Sequence

analysis

of

the

genome

of

Bombyx

mori

nucleopolyhedrovirus.

J

Gen

Virol,1999.

80

(

Pt

5):

p.

1323-37.

4.Mitchell,J.K.,N.M.

Byers,and

P.D.

Friesen,Baculovirus

F-box

protein

LEF-7

modifies

the

host

DNA

damage

response

to

enhance

virus

multiplication.

J

Virol,2013.

87(23):

p.

12592-9.

5.Wu,Y.,et

al.,Screening

of

candidate

proteins

interacting

with

IE-2

of

Bombyx

mori

nucleopolyhedrovirus.

Mol

Biol

Rep,2013.

40(10):

p.

5797-804.

6.Lin,G.,J.M.

Slack,and

G.W.

Blissard,Expression

and

localization

of

LEF-11

in

Autographa

californica

nucleopolyhedrovirus-infected

Sf9

cells.

J

Gen

Virol,2001.

82(Pt

9):

p.

2289-94.

7.Lin,G.

and

G.W.

Blissard,Analysis

of

an

Autographa

californica

nucleopolyhedrovirus

lef-11

knockout:

LEF-11

is

essential

for

viral

DNA

replication.

J

Virol,2002.

76(6):

p.

2770-9.

8.Zhang,J.,et

al.,Inhibition

of

BmNPV

replication

in

silkworm

cells

using

inducible

and

regulated

artificial

microRNA

precursors

targeting

the

essential

viral

gene

lef-11.

Antiviral

Res,2014.

104:

p.

143-52.

2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。

2.1研究内容

1）LEF-11核细胞定位研究

通过免疫荧光技术鉴定家蚕核型多角体病毒LEF-11蛋白定位在细胞核内，利用BrdU标记技术确定其定位于宿主细胞DNA复制中心。

2）LEF-11免疫共沉淀研究

通过过表达LEF-11,利用免疫共沉淀和质谱分析技术，分析过表达后对宿主蛋白表达的影响。

3）LEF-11相互作用蛋白研究

通过免疫荧光共定位LEF-11与筛选的宿主蛋白并通过免疫共沉淀等试验技术鉴定与LEF-11相互作用蛋白。

2.2研究目标

1）鉴定LEF-11核定位，分析其定位位置。

2）揭示LEF-11过表达对宿主细胞蛋白表达的影响。

3）通过筛选与LEF-11相互作用蛋白，鉴定LEF-11与宿主相互用蛋白。

2.3拟解决的关键问题

鉴定lef-11基因与宿主细胞相互作用蛋白。

3、拟采取的研究方案及可行性分析。

1）BmNPV

LEF-11蛋白核定位信号鉴定

利用LEF-11抗体免疫荧光分析LEF-11蛋白亚细胞定位，同时借助BrdU抗体对LEF-11在细胞核内进行精细定位；（该部分研究内容已完成）

2）BmNPV

LEF-11蛋白过表达对宿主细胞蛋白表达影响

①利用LEF-11蛋白过表达后，以LEF-11为诱饵蛋白，通过检测蛋白条带变化鉴定宿主细胞蛋白表达量差异的变化。

②通过质谱分析筛选与LEF-11相互作用的宿主蛋白。

3）lef-11基因相互作用蛋白研究

通过免疫荧光和免疫共沉淀技术，验证与LEF-11共定位的宿主蛋白及相互作用的蛋白。

（2）技术路线

本项目的技术路线如下图。

(3)关键技术

1)

免疫共沉淀技术。它决定了是否可以找到LEF-11互作的宿主蛋白，是研究lef-11基因对宿主细胞调控的前提条件；

2)

稳定高效的家蚕基因过表达技术。它决定了目标基因过表达的效率，是基因功能研究的控制性因素。

项目承担单位已经建立了以上关键技术的技术平台，并能熟练运用以上技术。同时，以上关键技术所涉及的仪器本单位都能提供和满足。

（4）可行性分析

1）在前期研究中，我们已经建立了高效蛋白相互作用研究平台。（相关数据已经发表在病毒学权威杂志Virus

Research上）。同时，我们对LEF-11核定位机制的研究也为此项目继续深入鉴定基础（相关数据已经发表在病毒学权威杂志Virus

Research上）。本项目选题既有理论意义，又有应用价值，研究方案切实可行，技术路线合理，所用实验技术方法先进，能够按期完成预定研究任务。

2）本项目承担单位为“家蚕基因组学国家重点实验室”，本实验室完成了家蚕全基因组测序和家蚕EST数据库构建，可为项目的实施提供了信息的支撑；本研究室有强大的基因组信息分析平台、家蚕细胞系平台、蛋白质组分析技术和病毒基因敲除等关键技术的技术平台，可为本项目的实施提供了技术保证。无论从前期研究基础、研究内容、研究方案和技术路线、团队成员组成和研究条件方面，都为本项目的实现提供了保证。因此，本研究方案是切实可行的。

4、本项目的特色与创新之处。

（1）项目特色

1）本项目将病毒基因的研究并未局限于对病毒自身的调控功能研究上，而拓展到病毒与宿主互作研究，因此在研究内容上具有特色；

3）本项目把生物信息学、分子生物学和病毒学新理论和先进方法结合在一起，利用免疫共沉淀、和过表达等先进技术，并充分利用交叉学科的优势，将其综合运用在LEF-11与宿主相互作用的研究中。因此，研究方法具有特色。

（2）项目创新之处

通过项目实施，可鉴定家蚕核型多角体病毒lef-11基因对宿主蛋白相互作用的蛋白，丰富和完善病毒-宿主互作的理论基础。因此，研究的理论和应用价值上具有创新性。

5、年度研究计划、预期研究结果及成果提供形式。

研究内容

年度及进展计划

预期结果

1-3月

4-6月

7-9月

10-12月

研究内容一：

LEF-11蛋白核定位研究

1）核定位鉴定

●

鉴定出核定位位置

研究内容二：

lef-11影响宿主蛋白表达

1）过表达分析

●

确定高效表达目的基因

3）银染分析

●

●

确认LEF-11影响宿主蛋白表达

研究内容三：

lef-11基因与宿主相互作用蛋白研究

1）质谱分析

●

●

筛选出与宿主细胞相互作用蛋白

2）免疫共沉淀

●

鉴定出BmN-SWU1宿主细胞中与LEF-11蛋白相互作用的蛋白

（2）预期研究结果

1）确定LEF-11蛋白核定位位置；

2）鉴定宿主细胞中与LEF-11相互作用蛋白。

3）在国内外重要刊物上发表论文1~2篇；

二、研究基础与工作条件

1、工作基础与条件

（1）、工作基础

本项目申请是建立在申请人从事家蚕病理学研究基础上的，申请人已获得与本项目相关的研究积累如下：

1)

LEF-11蛋白的亚细胞精细定位

为了分析LEF-11在病毒感染宿主细胞后的功能，通过共聚焦荧光显微镜分析了LEF-11亚细胞精细定位。结果显示：感染后12

h，在细胞核内可以检测到LEF-11以聚集的形式存在。为了精确标记LEF-11所在的核内区域，我们利用α-LEF11和α-BrdU双荧光标记了宿主DNA复制位点，结果表明：LEF-11在细胞质中表达后迅速的转运到病毒DNA复制中心。结合LEF-11表达时相，我们推测LEF-11不直接参与病毒DNA复制起始，可能调控基因组复制起始后的扩大（图1）。这些研究结果为解析LEF-11蛋白对宿主复制增殖的调控作用奠定了基础。

图1

LEF-11的亚细胞定位

2)LEF-11过表达后

为了分析LEF-11过表达后，分析LEF-11表达量，通过Western

blot分析了LEF-11过表达后，LEF-11蛋白表达效率。为了精确验证LEF-11过表达后宿主蛋白变化，我们利用α-LEF11抗体标记了LEF-11蛋白表达量，结果表明：LEF-11过表达后，宿主细胞高效表达了目的蛋白，为进一步分析鉴定了基础（图2）。这些研究结果为进一步分析LEF-11蛋白过表达后宿主蛋白变化奠定了基础。

图2

LEF-11过表达效率分析

（2）、工作条件

本项目将依托“家蚕基因组生物学国家重点实验室”完成。本研究室是我国蚕学学科唯一的国家重点实验室，并有特种经济动物饲养全国重点学科为支持。实验室拥有10000M2的专用实验室和4000M2的养蚕设施。拥有核酸分析、蛋白质分离纯化、细胞培养与染色体研究、转基因动物、微生物和生物信息分析的专用实验室，拥有遗传分析仪、飞行时间质谱仪、蛋白质双向电泳系统、显微注射仪、Dige

Enabled

Typhoon、流式细胞仪、SNP分析仪和激光共聚焦显微镜等各类仪器设备3100余台/套，设备总价值4000万元。这些高通量、高效率和高起点的功能基因研究平台，能满足本项目研究的需要。

2、申请人简介

1．董战旗

1）个人简介（应包含本项目中承担的任务）

董战旗，西南大学，家蚕基因组生物学国家重点实验室，博士生，本项负责人。从事家蚕病理学研究。参与国家自然基金项目，发表论文5篇，其中以第一作者发表于病毒学权威杂志Virus

Research上一篇。

2）受教育经历

·

2014/09－，西南大学，家蚕基因组生物学国家重点实验室，博士

·

2012/09－2014/06，西南大学，家蚕基因组生物学国家重点实验室，硕士

·

2008/09－2012/06，太原师范大学，生命科学系，学士

3）科研成果

[1]

Dong

ZQ,Zhang

J,Chen

XM,He

Q,Cao

MY,Wang

L,Li

HQ,Dong

XL,Pan

CX,Lu

C.*,Pan

MH*.

Bombyx

mori

nucleopolyhedrovirus

ORF79

is

a

per

os

infectivity

factor

associated

with

the

PIFs

complex.

Virus

Research.

http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2014.02.009

[2]

Zhang

J,Dong

ZQ,He

Q,Chen

CM,Cao

MY,Li

HQ,Xiao

WF,Lu

C.*,Pan

MH*.

Identification

of

a

novel

nuclear

localization

signal

of

baculovirus

late

expression

factor

11.

Virus

Research

http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2014.02.020.

[3]

Zhang

J,He

Q,Zhang

CD,Chen

XY,Chen

XM,Dong

ZQ,Li

N,Kuang

XX,Cao

MY,Lu

C.*,Pan

MH*.

Inhibition

of

BmNPV

replication

in

silkworm

cells

using

inducible

and

regulated

artificial

microRNA

precursors

targeting

the

essential

viral

gene

lef-11.

Antiviral

Res.

104

(2014)

143–152.

[4]

董战旗，张军，鲁成，潘敏慧*

.家蚕核型多角体病毒ie1基因多克隆抗体制备及功能初探.

西南大学学报.

2014.10

三、经费预算说明

四、申请者承诺

我保证申请书内容的真实性。如果获得专项资金资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守有关规定，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。

签字：

日期：

五、导师推荐意见

(请学生导师填写意见，并承担监督本项目执行的责任)

导师（签字）：

日期：

六、学院（所、中心）审查意见

已按有关规定和申报通知要求对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予保障，督促项目负责人认真开展研究工作，及时报送有关材料。

负责人（签字）：

单位公章

日期：

七、学校领导小组意见

建议资助金额

万元

建

议

立项意见*年*月*日