生物技术抗生素已成为医药行业发展最快的领域，我国生物技术抗生素的研发也处于高速发展阶段。 自由基蛋白、单克隆抗原等生物大分子抗生素及其生物类似药的开发是生物技术抗生素领域公认的研究热点，是目前治疗血液恶性肿瘤和实体瘤最成功、最重要的策略之一。 新的靶向抗原和新的抗原性抗生素不断涌现，如纳米抗原、双靶点单克隆抗体、抗体药物偶联物（ADCs）等。 但是，在使用上述抗生素进行治疗时，会存在一个不容忽视的问题，那就是抗原的免疫原性。 临床上，免疫原性可能会降低抗生素的作用或引起机体严重的不良反应； 临床前，免疫原性对抗生素具有竞争性抑制作用，可能中和抗生素的活性，影响抗生素的清除率、血浆半衰期和组织分布，改变药效或药代动力学，使非临床研究中观察到的效果可能不是抗生素真正的毒理学和/或毒性反应。 因此，临床前和临床试验中的免疫原性评价是生物技术抗生素临床试验注册研究数据的重要组成部分，对预测和阐明此类抗生素的临床安全性和有效性具有关键作用。
1 免疫原性形成的影响及原因
抗生素的免疫原性是指抗生素刺激机体产生特异性抗原或致畸淋巴细胞的特性。 许多因素会影响生物技术抗生素的免疫原性。
1.1 内生诱因
内源性诱因与抗生素本身的特性有关出院患者体内有特异性抗体，如抗生素的分子大小、异源多肽的序列、产物的含量等。
1.1.1 分子大小对于不表达该分子的育苗植物，相对分子量（RMW）小于10000的蛋白质氨基酸常具有免疫原性，RMW为5000～10000的蛋白质氨基酸也可能具有免疫原性，但由此产生的免疫反应相对较弱。 无法预测 RMW 在 1000 和 5000 之间的化合物的免疫原性。 据报道，分子结构复杂者免疫原性强，反之亦然。
1.1.2 异源多肽序列来自非人多肽序列（如小鼠抗原等）、不同的人多肽序列，以及为增强功能或延长半衰期（点突变、糖基改变、添加脂肪酸、去除藻类）碳水化合物、聚乙二醇化、Fc 融合、双特异性抗原和抗原-抗生素偶联物）。
1.1.3 产品含量 亲和素含有细胞基质、培养基成分等杂质，会直接引起免疫原性，或起佐剂作用。
1.2 外因诱因
外源性触发包括给药途径、配方、给药频率和时间、包装材料，甚至与宿主的密切关系。
1.2.1 给药途径给药途径在一定程度上影响蛋白的免疫原性，有证据表明免疫原性蛋白不易通过皮下注射给药，例如，因为绝大多数纯红细胞性胃炎（PRCA）病例发生在促红细胞生成素α（EPOα，Eprex）的皮下注射中，因此意大利药品注册局将Eprex限制为静脉给药途径。 但本质上，皮下注射本身并不能使蛋白由非免疫原性变为免疫原性，改变给药途径也不能使免疫原性本身消失，只能使免疫原性蛋白免疫应答的概率增加。
1.2.2 配方不合理、贮存或运输不当可能引起蛋白质聚集或变性，从而提高其免疫原性。 许多抗生素需要增加抗原表达以降低成本。 结果，糖基化修饰没有跟上，导致多聚体形成，而抗原产生过程中没有去除多聚体的步骤，所以多聚体是免疫原性形成的主要原因。 以重组人促红细胞生成素α（Epoetin α，Eprex/Erypo）为例。 1988年首先在法国获准上市，用于刺激肝炎患者或接受放疗患者的红细胞生成。 Eprex 最初富含人血清白蛋白，后 EC 监管机构鼓励 Eprex / erypo 开发不含人血清白蛋白的配方，以通过增加病毒性疾病传播的风险来提高安全性。 2002年，Nicole Casadevall院士等报告13例纯红细胞再生障碍性贫血（PRCA）检出外源性和内源性促红细胞生成素中和抗原。 后来报道，1998年至2004年共有191例PRCA患者有上述中和抗原的形成，其中2001年发病率最高，且仅在法国出现，并未出现法国出现，日本仍沿用含人血清白蛋白的配方。 因此推测，PRCA病例中促红细胞生成素中和抗原形成的诱导可能是重组人促红细胞生成素在清除白蛋白后的积累和氧化，导致抗体性质发生变化。
1.2.3给药频率和时间IgM以单次注射为主，IgG以多次注射14天后为主。 给药间隔时间越长，抗药物抗原（ADA）的亲和力越高。 患者的用药依从性增强，药效可迅速提高。 因此，FDA指出，抗生素研发是一项常年系统工程，对免疫原性的关注必须贯穿抗生素研发和上市后的始终。
1.2.4 包装（含密封系统）材料 以Eprex为例，其免疫原性的形成可能还与所用的包装材料有关。 研究发现，注射器中的硅油在一定条件下可能引起促红细胞生成素的蓄积，从而引起抗促红细胞生成素抗原的产生。
1.2.5 宿主诱导生物技术抗生素具有免疫原性，但并不意味着一定会诱导患者产生免疫反应。 比如Erbitux和Avastin，非临床研究表明，它在健康猴子中的ADA较高，但由于接受治疗的患者原本免疫功能低下，在接受放疗和化疗后，免疫系统几乎被完全破坏，所以ADA的Erbitux 和 Avastin 的发生率很低。 相反，在患有自身免疫性疾病的患者中，免疫系统高度敏感，尽管最初较弱的免疫原性会被放大许多倍。
2 免疫原性评价的意义
免疫原性是生物技术抗生素安全性评价的重要内容，主要表现在以下三个方面：
对于患者和医生而言，免疫原性会影响抗生素的安全性和有效性。 对于个别治疗性蛋白质，抗药物抗原反应可导致各种临床不良反应，包括过敏、自身免疫和不同的药代动力学特征，如抗生素中和、生物分布异常和抗生素消除率增加。 改变抗生素的效力。
对于企业来说，开发风险大大降低。 免疫原性无法预测，因为免疫原性的强弱与很多因素有关，包括抗生素活性成分、杂质、辅料种类、稳定性、给药途径、剂量、试验组等，再加上临床前免疫原性的局限性用于临床免疫原性预测和评价的检测，有时在临床上发现ADA问题，损失惨重。
对于药监部门而言，免疫原性也是影响抗生素临床研究或上市许可决策的风险因素之一。 许多国家的监管机构要求在临床前毒理学或药理学研究中使用经过验证且合规的免疫疗法。 原创性研究所需的方法是评估抗抗生素抗原。 例如，英国乳品药品管理局（FDA）要求所有生物药品在上市前必须提供免疫原性评价数据，以确保抗生素的安全性和有效性。
3 免疫原性评价内容
临床前和临床试验中的免疫原性评价是生物技术抗生素注册申请研究的重要组成部分。 在评价内容上，非临床和临床免疫原性评价各有侧重。
3.1 临床前免疫原性评价
在临床前免疫原性评价中确定抗生素的结合抗原有助于对非临床研究结果做出更合理的解释。 一般采用多层次的检测方法，包括筛选试验、确认试验（confirmatory assay）、抗体滴度试验（titering assay）、中和抗原试验（neutralization assay）和（或）抗原亚型分析[6-7]。 首先，测量结合抗原。 如果测定结果显示有抗原反应，则需要进一步研究抗原反应，如抗原滴度、抗体反应转阴率、是否为中和抗原、抗原的亚型等。 还应与毒理和（或）药理变化联系起来，综合分析，如抗原形成是否对药代动力学、药效学、补体激活、毒性反应的发生有影响。 据报道，还应注意与抗原形成和免疫复合物产生和沉积相关的病理变化。
3.2 临床免疫原性评价
生物技术药物的临床免疫原性研究主要集中在其对安全性和有效性（增强、降低和失效）的影响。 研究中的受试者数量应足够大，采样时间、样本处理/储存以及用于数据分析的统计方法都需要有科学依据。 抗原测定方法应具有高特异性和高灵敏度。 免疫原性风险越大，分析测量方法的开发越早，对免疫原性的关注需要贯穿整个研发和上市后。 抗原检测的观察期取决于抗生素的疗程、抗体形成的预期时间和后果。 以抗原检测频率为例，如果存在与抗生素相似的内源性蛋白，其功能非常重要，或者抗生素可能引起特异性反应，则需要进行详细的免疫原性研究，抗原检测频率也是如此最密集的； 对于因免疫原性可能引起毒性反应的生物技术抗生素，抗原检查的频率次之； 对于免疫原性低或无免疫毒性风险低的生物技术抗生素，可适当延长抗原检查频次[8]。
4 免疫原性检验技术和工艺验证要点
免疫原性是生物技术抗生素安全性和有效性评价中的关键评价之一，抗生素的免疫原性可以通过测定抗药抗原来评价。 开发和建立免疫原性测试的技术模式（例如结合抗原和中和抗原测试技术）更具挑战性。
4.1 常用抗原检测方法
目前检测抗原抗生素ADA的方法有很多，如桥接ELISA、间接ELISA、放射免疫沉淀（RIP）、表面等离子共振（SPR）等。
4.1.1 Bridge ELISA 法 本方法用于抗生素包被，与标记抗生素进行核对。 优点是可以测小龙的量和各种抗原亚型，没有种属特异性。 缺点是亲和力低，不易测 包被或标记时，可能会隐藏或改变抗生素的抗体表位，易受抗生素本身的干扰。
4.1.2 直接ELISA法 本法用于抗生素包被和标记抗原检测。 优点是可以检测低亲和力的抗原。 缺点是抗生素表位在包被时可能被隐藏或改变，具有种属特异性。 低亲和力的抗原在第一次洗涤时很容易丢失。
4.1.3 间接ELISA法 该方法包被抗体或生物素，然后给药。 优点是抗生素与包被单克隆抗体结合后仍能保持抗体表位的暴露。 缺点与上面的直接方法类似。
4.1.4 生物层干涉法(Bio-Layer interferometry) 生物传感与抗生素耦合，然后加入样品。 该方法的优点是气相法，通量高，自动化，无需使用酶标抗原，可测定不同亲和力的抗原和各亚型抗原，无种属特异性。 缺点是需要专用仪器，灵敏度较低。
4.1.5 本方法的优点是气相法，可测定多种抗原亚型，无种属特异性，灵敏度高。 缺点是需要制备两种标记物（生物素和TAG），标记分子的表位在标记过程中可能发生变化，需要特殊设备，所用试剂不通用。
4.1.6 放射免疫沉淀（RIP） 该方法的优点是固相法，灵敏度高，中等或mediatek水平，缺点是使用核素，核素半衰期短，核素标记影响表位暴露. 具体是因为标记的抗生素非特异性地夹带在颗粒中，因此相对于液体表面的结合较弱。
4.1.7 中和抗原测定生物技术抗生素在动物体内形成的抗原不一定具有中和活性，需要监测生物技术抗生素或结构/功能相关的内源性蛋白的中和活性。 抗原中和活性的测定方法通常采用剂型的生物活性测试方法，如使用基于细胞的抗原中和活性测试。
4.2 耐药抗原分析方法验证的一般原则
临床和非临床研究通常通过测量和表征对药物抗原的反应来评估抗生素的免疫原性。 无论采用哪种方法，在方法开发和优化后，都应进行后续的方法学验证，以确保该技术的性能适合相应的测量要求。
在开始验证前，制定相应的验证实验方案，说明分析方法的预期目的、具体的分析方案、需要验证的性能特点，以及预期的精密度、稳健性、稳定性等初步检验标准。 当验证阶段的分析数据不符合初始验证标准时，应拒绝该数据。 如果有明显的诱因（例如技术偏差），则应排除有意或无意偏离实验方案而获得的分析数据，否则应估计所有分析数据。 目前，新加坡乳品和药物管理局（FDA）的指导文件明确了免疫原性检查方法的开发和验证应包含的主要研究内容[7]。 抗药抗原免疫分析方法学验证应确定以下参数：筛选临界点、确证临界点、灵敏度、耐药性、精密度、稳健性、稳定性等。
4.2.1 筛选切点（Screening cutpoint） 筛选切点定义为筛选试验的响应水平，响应值低于该临界点的样品为活性样品（或称为潜在阴性），响应值为高于这个临界点就是阳性样本。 为确定切点，应在验证阶段使用来自抗生素使用目标人群或受试者的样本来解剖足够数量的样本。 这使得能够对生物和解剖变异进行有效的统计评估。 6个分析批次的检验应由不同的分析人员至少在不同的3d次内对同一样品进行2～3次测定，临界点（平均值加1.645标准差）通常可采用参数法估算。
4.2.2 确证切点(Confirmatory cutpoint) 特异性是指分析方法在其他基质成分存在的情况下，能够清晰测定目标分析物的能力。 由于筛选截止值允许 5% 的假阴性率，因此筛选分析筛选的活性样本可能是非特异性的。 因此，有必要区分负样本和活性样本的特异性。 特异性的验证性测定通常是一种竞争性抑制测定，通过测量与或未与研究抗生素预孵育的样品中的信号变化来评估。 建议在验证筛选截点期间评估特定的确认性截点。 估计未加标抗生素样品（抑制）的平均值和标准误差 (SD)，特异性确认截止点是抑制平均值加上 SD 值的 2.33 倍（假设预期假阴性率为 1%）。
4.2.3 灵敏度（Sensitivity） 抗药抗原分析的灵敏度是指能稳定形成阴性信号的最低阴性对照抗原含量。 FDA 2016指南要求抗药抗原测定的灵敏度要达到100ng/mL，可见检测的灵敏度是非常关键的。 一些生物技术抗生素可通过形成低效中和抗原而引起临床不良反应。 因此，有必要开发一种更灵敏的方法来有效地测量耐药抗原。
4.2.4 抗生素干扰研究（耐药性） 耐药抗原监测中的主要干扰物质一般来自抗生素本身。 由于目标抗生素与试验所用特异性抗原的形成存在竞争作用，给药后血液中存在的抗生素可能会干扰抗药抗原的测定，造成假阳性。 一般做法是确定抑制阴性对照抗原测量的抗生素量，并将此耐药限值应用于研究样本中抗药抗原的抗生素干扰情况。 与灵敏度类似，药物耐受性仅限于了解测试中的抗生素是否会干扰，可用于在技术开发和优化阶段比较不同的方法。 尽管如此，在抗药抗原的研究中需要确定耐药性。 据报道，在提高抗生素耐受性方面，酸处理、液相ELISA等方法有助于抑制抗生素干扰，提高测定方法对ADA的反应[9]。
4.2.5 精密度（Precision）分析方法精密度定义为检测值的相对标准偏差（变异系数CV%），用来描述被测物重复测定的接近程度。 预期范围； 它还应该适合所使用的平台。 检验方法准确度时，同一样品至少应在不同的3天内测定2～3次，以评价批内和批间检验的偏差。
4.2.6 稳健性（Robustness） 稳健性是指分析方法的参数发生微小变化时，分析方法不受影响的能力，也可表示分析方法的可靠性。 这些参数包括孵育时间、温度、微孔板批次、试剂批次和内容物或设备等。
4.2.7 稳定性(SampleStability) 稳定性研究用于评价分析方法在预期样品储存条件下的分析性能。 理想情况下，稳定性测试条件应模拟预期的样品和试剂制备条件、储存温度和不同的储存时间。 添加阴性对照抗原的基质可作为模??拟阴性样品进行测定，最好使用低、中、高含量质控样品考察分析物的稳定性。
4.2.8 最小所需稀释度（MinimalRequiredDilution） 在分析方法的构建和验证过程中，需要使用缓冲液对生物样品进行必要的稀释，以增加其形成的高背景信号，提高帧率，减少矩阵干涉。 因此，应考虑最小稀释度。 最小稀释倍数应从10个未根除个体的样本检测中确定，测得的信号接近于测量稀释度非特异性结合的信号水平，通常不低于100倍稀释度。
4.2.9 阴性/阳性对照品及试剂阴性对照抗原（或血浆）可通过订购市售产品获得。 如果没有市售产品，则应通过免疫植物来制备阴性对照抗原。 为了评价非特异性背景，需要制备阳性对照，阳性对照血浆通常需要从15只昆虫或50人身上提取。
该方法的关键试剂，如结合蛋白、抗体或偶联抗原、酶等，将对分析结果产生直接影响，因此必须保证质量。 如果在方法验证或样品分析过程中改变了关键试剂的批次，必须确认不会改变方法的性能，从而保证不同批次结果的一致性。 无论是关键试剂还是缓冲液、稀释剂等非关键试剂，都应记录保持其稳定性的保证条件，以保证方法性能全年不变。
4.2.10 小结 事实上，在测定抗生素诱导的抗原时，应充分考虑抗生素（如治疗性蛋白或单克隆抗体）的特性和药物的干扰。 具有一定的特异性和灵敏度，可检测低效价抗原和靶向线性表位或功能组表位的抗原。
5.免疫原性评价的未来问题
随着生物技术抗生素的快速发展，也给抗生素的免疫原性评价带来了挑战。 如何优化测量技术，实现评价方法的标准化和规范化，提高植物模型的可预测性，是未来免疫原性评价亟待解决的问题。
5.1 方法的归一化和标准化
目前，国内外尚无完整的免疫原性临床前检测指南，多部指南中对此要求较为分散，测量方法、要求和解释也不统一。 此外，由于每种生物技术抗生素具有不同的特性，因此无法具体推荐单一的测量方法。
5.2 耐药抗原测定方法优化
目前耐药抗原的测定存在很多问题。 例如在灵长类动物实验中，由于猴与人同源性高，测定时会形成交叉干扰，产生高背景反应； 基质中可能富含研究用抗生素、内源性抗原和痛风样因子等，可能抑制抗药性抗原与抗生素的结合； 体内形成的抗药抗原与抗生素结合会影响抗原监测； ADC抗生素在动物体内诱导的抗药性抗原水平低，需要灵敏的测量方法； 许多植物血浆中的特异性抗抗原亲和力普遍较低，这也对测量方法提出了新的要求和标准。
5.3 对象模型的可预测性
在临床前药理学试验中，耐药抗原的测定可以在一定程度上反映生物技术抗生素的免疫原性，但由于不同种类的植物和人体免疫系统之间存在巨大差异，植物试验中观察到的免疫反应并不能反映生物技术抗生素的免疫原性。并不一定意味着被测试的抗生素在人体中形成??相同的免疫反应。 甚至一些生物技术抗生素在植物实验中被发现具有免疫原性，但在临床实践中基本无免疫原性。 没有显着相关性，因此从植物试验结果外推到临床试验时应谨慎。
尽管如此，非人类灵长类植物目前是大多数生物技术抗生素免疫原性测试最好的植物。 临床报道的阿达酰亚胺ADA为43%～51%，临床前在健康猴子中观察到的阿达力木ADA为41.7%，与健康人的数据非常接近，说明猴子和人没有太大区别。 事实上，健康植物或健康人的ADA数据必须加上影响患者免疫系统的因素才能预测患者免疫反应的硬度。 据悉，当植物数据外推到人类时，还需要考虑到抗生素的接触时间比植物短，无法确定抗原形成时间出院患者体内有特异性抗体，有些抗原可能要到12个月才会出现给药后。
6结语
生物技术药物是目前抗生素研发的热点，但几乎所有的生物技术抗生素仍具有一定的免疫原性，可能会增加抗生素的药效或引起严重的不良反应。 因此，生物技术抗生素的免疫原性问题必须引起高度重视。 免疫原性和抗生素安全性和有效性之间的联系依赖于临床前和临床研究中抗药抗原的客观检查和表征。 因此，在评价生物技术抗生素的免疫原性时，应充分考虑方法的适应性，设计有效可行的测定方法，形成高质量的抗药性抗原数据，并结合PK、安全性和安全性。疗效数据进行评价。 综合判断，从而更好地了解和预测免疫原性对毒性或效应可能产生的影响。
文献来源
黄英、姜华、李璐璐、李薇、王鑫、霍艳。 生物技术抗生素免疫原性评价技术发展概况. 抗生素评价研究, 2017,40(7):999-1004.