实验六-纸层析法观察转氨基作用--实验报告 本文关键词：层析，实验，氨基，观察，作用
实验六-纸层析法观察转氨基作用--实验报告 本文简介：实验六纸层析法观察转氨基作用【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用09救援一班第三大组李岚宇2009222336室温：28°（一）实验目的：1、学习氨基酸纸层析的基本原理。2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。（二）实验原理：转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α
实验六-纸层析法观察转氨基作用--实验报告 本文内容：
实验六
纸层析法观察转氨基作用
【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用
09救援一班
第三大组
李岚宇
2009222336
室温：28°
（一）实验目的：
1、学习氨基酸纸层析的基本原理。
2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。
（二）实验原理：
转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：
α—酮戊二酸
+
丙氨酸
谷氨酸
+
丙酮酸
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示：
物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。
（三）实验材料与仪器：
试剂：
1、0.01mol/L
pH
7.4磷酸盐缓冲液。
2、0.2mol/L
Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L
NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。
3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L
pH
7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0
N
NaOH仔
细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至100ml。
4
、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L
pH
7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0
N
NaOH仔细调至pH
7.4
后，加磷酸盐缓冲液至100ml。
5、0.1mol/L
谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH
7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0
N
NaOH仔细调至pH
7.4
后,加磷酸盐缓冲液至50
ml。
6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100
ml丙酮中溶解。
7、层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。
仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。
（四）实验步骤:
1、肝匀浆制备：取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH
7.4磷酸盐缓冲液1.0
ml,迅速研成匀浆，
用上述缓冲液4.5ml混匀备用。
2、
酶促反应过程
（1）取离心管两支，编号：1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0.
5ml。把对照管放沸水浴中加热10分钟，取出冷却。
（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5
ml,0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5
ml,0.01mol/L
pH
7.4磷酸盐缓冲液1.5
ml,摇匀。
（3）37℃保温，30分钟后取出，保温完毕。
（4）
把测定管放沸水浴中煮10分钟，取出后冷却，过滤。
3、层析
（1）
取圆形滤纸一张（直径9cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约1
cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。
（2）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。把测定液、对照液分别点在原点1、3处。注意斑点不宜过大（应在直径0.5cm以下）。在第一次点样点干后，再在原处同样点第2次。
（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。
（4）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘约1cm时，约25分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。
（5）
显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。
（五）实验结果记录：
图（1）
点样溶液
色斑个数
溶质中心到原点中心的距离
溶质前缘到原点中心的距离
Rf值
测定管上清液
2
未知溶质a
1.50cm
2.50cm
0.6
未知溶质b
0.40cm
2.50cm
0.16
丙氨酸
1
1.30cm
2.20cm
0.6
对照管上清液
1
1.50cm
2.50cm
0.6
谷氨酸
1
0.40cm
2.20cm
0.16
表格（1）
（6）
实验讨论：
1、从表格（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。
2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。
3、层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。
4、点样点不宜过大，直径小于0.5cm.
2010年9月19日
篇2：西北大学研究生科研实验资助项目-用于黄曲霉毒素定量检测的金磁微粒标记快速层析试纸条的研制申请书
西北大学研究生科研实验资助项目-用于黄曲霉毒素定量检测的金磁微粒标记快速层析试纸条的研制申请书 本文关键词：层析，黄曲霉，试纸，微粒，毒素
西北大学研究生科研实验资助项目-用于黄曲霉毒素定量检测的金磁微粒标记快速层析试纸条的研制申请书 本文简介：年度编号研究生科研实验资助项目申请书项目名称用于黄曲霉毒素定量检测的金磁微粒标记快速层析试纸条的研制申请人姓名王艳霞导师姓名崔亚丽学科专业生物化学与分子生物学申请人单位生命科学学院申请日期2010年10月9日西北大学研究生处二〇一〇年九月制一、基本情况项目名称用于黄曲霉毒素定量检测的金磁微粒标记快速
西北大学研究生科研实验资助项目-用于黄曲霉毒素定量检测的金磁微粒标记快速层析试纸条的研制申请书 本文内容：
年度
编号
研究生科研实验资助项目申请书
项
目
名
称
用于黄曲霉毒素定量检测的金磁
微粒标记快速层析试纸条的研制
申
请
人
姓
名
王
艳
霞
导
师
姓
名
崔
亚
丽
学
科
专
业
生物化学与分子生物学
申
请
人
单
位
生命科学学院
申
请
日
期
2010年10月9日
西
北
大
学
研
究
生
处
二〇一〇年九月制
一、基本情况
项目名称
用于黄曲霉毒素定量检测的金磁微粒标记快速层析试纸条的研制
姓名
王艳霞
学号
200921017
单位名称
生命科学学院
专业
生物化学与分子生物学
指导老师
崔亚丽
电话
15291994185
电子信箱
[email protected]
学位论文题目
纳米金磁微粒标记技术在快速定量检测黄曲霉毒素中的应用
申请资助金额（元）
0.5万元
预计完成时间
二年
导师是否有配套资助资金
是
配套资助资金金额
0.5万元
二、项目依据
本项目的理论意义和实践意义、项目创新点、国内外研究状况分析。
黄曲霉毒素(Aflatoxins,简称AFT)是本世纪60年代初发现的由曲霉属中的黄曲霉和寄生曲霉所产生有毒代谢产物，它是一种肝脏毒素，是迄今为止发现的毒性最强的生物毒素之一，AFT同时具有致癌作用。1993年，世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构将其划定为一类致癌物。目前已经在粮食、油料作物的种子、干果、调味品、发酵产品和饲料内，甚至在酒类等多种农产品及制品中发现了AFT的存在。AFT是含有双呋喃环和氧杂萘邻酮的杂环化合物，已经发现的AFT有B1、B2、B2a、G1、G2、M1、M2、Q1、Q2a等17种之多，其中AFB1毒性最强。
目前建立的针对AFT的检测方法主要有：薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法、免疫亲和柱法和电化学法等。其中高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法、免疫亲和柱法等亦可很好的完成定量工作，检测线可以达到6
ppt。然而这些方法存在操作复杂、过程烦琐、检测时间长、劳动强度大，仪器设备昂贵、需要专门的技术人员等缺点。快速ELISA、免疫亲和柱-荧光计法，电化学等方法同样需要配备相应的仪器设备。寻求快速、准确且经济可行的检测方法已成为AFT研究中亟需解决的任务之一。胶体金层析试纸法在定性检测方面具有简单、快速（3-5
min）、灵敏
(4
ng/mL或更低)，无需仪器设备，可以很方便的在实验室、农场、饲料混合车间等多种场所进行实地测定。更重要的是，该方法检测成本低，便于广泛的推广和应用，在AFT检测方面具有广阔的应用前景，但该方法依然存在不能实现定量检测的缺点。
核壳型磁性纳米微粒是一种金包被的Fe3O4纳米粒子，该微粒中的Fe3O4具有超顺磁性，表面包被的金又具有纳米金的光学性质；其表面经过功能化修饰后，金磁微粒具有良好的分散性和在缓冲液中抗团聚能力，同时末端的功能化基团能偶联各种生物大分子（特定的核酸片段、抗体、抗原等）。这些特性使该磁性纳米微粒可以很好的用于医学领域和生物分子的定性定量检测；既方便快捷，又可实现可目视化。本研究正是充分利用了纳米金磁微粒的这些特性，用纳米金磁微粒代替胶体金，研制金磁微粒标记快速层析检测试纸条，实现对黄曲霉毒素的定性以及定量测定。该方法既可克服胶体金层析试纸不能定量的缺陷，又具有试纸检测的巨大的优越性，具有广阔的应用前景。
三、研究基础
1.近期已取得的与本项目有关的主要研究成果
1.近期已取得的与本项目有关的主要研究成果
在本实验室已有工作的基础上，对合成的核壳型磁性纳米微粒进行表面功能化修饰，得到了具有纳米光学效应的超顺磁性纳米金磁微粒，以下是相关的研究结果：
（1）合成得到纳米级金磁微粒，其TEM照片及表面Zeta电位的检测结果如下：
Zata
potential：40.5mv
（2）具有较高稳定性的纳米金磁微粒，具备特有的光学效应，结果如图所示：
在经过不同方式处理后的纳米金磁微粒，具有特有的颜色，照片如下图所示：
由于纳米级金磁微粒兼有超顺磁性以及胶体金的光学性质，该材料是分子检测的良好的标记材料，通过前期的摸索实验，已经能够用在检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)，检测结果如下图所示：
2.
已有研究条件
生物化学与分子生物学专业依托国家微检测系统工程技术研究中心，中心以集成生物学、化学、材料学、精密机械加工、光电子检测等领域的前沿技术和多学科交叉为特点，通过装置微型化，实现生物医药领域微量化检测的高度集成。中心现有工程技术研究人员六十余人（包括9位海外专家），培养及共同培养博士、硕士近60人，微检测领域技术带头人10人。已建成微阵列系统、纳微米磁性材料、细胞色素酶P450药物筛选和个体化用药、人血液代用品等技术平台。承担国家“十五”“十一五”863重大专项等国家级项目十余项。开发出了多项具有自主知识产权的新产品和新技术，包括四大类50余种新产品和新仪器设备。申请专利60余项，获授权20项（美国专利1项）。“磁性复合微粒及其在生物医学领域中的应用”获2004年陕西省科学技术进步一等奖。目前已同国内外三十多家科研机构与企业形成广泛合作，建立了具有创新发展能力的微检测系统研发体系和产业雏形。
本课题组经过13年的努力，已研制出具有自主知识产权和功能独特的新型磁性微粒，在已有的具有自主知识产权的成果基础上，项目组对原始技术不断的进行应用创新和产品开发，结合胶体金表面生物分子可修饰性和磁性纳米粒子超顺磁性双重特质，将单质金还原在磁性氧化物粒子表面，发明了核壳型Fe3O4/Au磁性微粒；在修饰有功能团的氧化物粒子表面组装纳米金，发明了组装结构的Fe3O4/Au磁性微粒，项目组将上述两种微粒命名为金磁微粒（GoldMag
Particles）；该成果已获授权专利11项，其中美国发明专利1项，中国发明专利9项，实用新型专利1项；针对新型磁性微粒合成和应用产品的拓展升级，申请了中国发明专利21项，其中已公开11项，围绕核心技术原始创新和应用产品集成创新的专利群已经形成；在国内外发表相关论文40余篇，纳米金磁微粒的光学性质及应用研究还有许多值得开展研究的工作。
四、研究方案
项目研究内容、研究思路、实验方法（包括重点难点、解决途径）等。
本项目的内容包括：
1、对合成的核壳型磁性纳米微粒进行表面功能化修饰
1）酸处理去除纳米金磁微粒未包裹的氧化物粒子（通过实验已基本掌握了酸处理除去氧化物粒子的条件）。
2）将酸处理后核壳型纳米金磁的表面功能化修饰，主要原理就是
Au与SH-的反应使纳米金磁表面带有一层功能基团使其具有很好的分散性和具纳米金光学性质，同时在PBS，生理盐水的条件下不发生团聚，能更便于偶联生物分子而仍然具有好的分散性和光学性质（这一部分内容通过实验已经基本获得了非常好的实验结果。
2、
AFB1完全抗原的制备
1）优化乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC）法制备AFB1完全抗原的条件。
2）AFB1完全抗原的鉴定与评价：包括测定抗原浓度、纯度和特异性以及蛋白偶联率。
3、金磁标记抗体层析试纸条检测黄曲霉毒素
1）金磁标记抗体的制备：优化金磁标记抗体的条件和优选最佳的标记抗体稀释液，以保证标记抗体在试纸条上顺利展层。
2）试纸条的组装：优选试纸条组件材料，并以适宜的结合垫处理液处理结合垫。然后按一定的规格组装试纸条。金磁标记试纸条检测黄曲霉毒素的原理如下：
2）检测
检测线和质控线同时出现红色条带，则样品呈未出现条带，试纸条检测结果无效。
3）确定试纸条的检测限以及阴性。如果仅质控线出现红色条带，样品呈阳性。如果质控线对试纸条使用效果的进行初步评价
与ELISA法、HPLC法进行比较并确认同时测试试纸条的特异性、稳定性。
4）通过磁信号对试纸条上的黄曲霉毒素进行定量检测，这是金磁标记试纸条最突出的优点，既定性又定量。
通过以上方法进行黄曲霉毒素的检测能够比胶体金层析试纸的检测方法更灵敏同时做到定量检测。通过对核壳纳米金磁微粒的表面功能化修饰能克服纳米金在不同缓冲液中发生团聚而影响后续的生物分子的检测，同时具有功能化的末端（如羧基末端）的金磁微粒能够比纳米金更快速牢固的偶联生物分子。具有磁性的Fe3O4且不需要高速离心仅需要磁性分离架就能快速方便完成偶联不同的生物分子。并且具有金壳层的表面保持了纳米金特有的光学性质，从而实现了对黄曲霉毒素的快速定量检测。为检验新方法的建立奠定基础。
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五、预期研究成果
研究阶段（起止时间）
阶段成果名称
成果形式
2010.10至2010.12
对核壳型的纳米金磁微粒进行表面功能化修饰
申请专利1项
2010.12至2011.1
AFB1完全抗原的制备
完成AFB1完全抗原制备
2011.1
至
2012.1
金磁标层析试纸条定性检测黄曲霉毒素
实现黄曲霉毒素定性检测
2012.1至2012.4
金磁标层析试纸条定量检测黄曲霉毒素
发表SCI论文1篇
六、经费预算
预算科目
金额（元）
计算根据和理由
药品费
6700元
修饰核壳型纳米金磁微粒的所需试剂与原料，黄曲霉毒素检测检测所需试剂与原料
仪器检测费
1000元
用于纳米金磁微粒表征、表面修饰材料表征等
资料费
300元
购买参考资料及图书
其它费用
2000元
发表国外文章与撰写专利、参加国内学术会议
合
计（元）
10,000
注：预算科目按下列顺序填写：
1.
药品费；2.仪器检测费；3.资料费；4.其他费用。
七、导师和培养单位及接收单位意见
导师意见：
导师：*年*月*日
培养单位意见：
培养单位负责人：
单位（公章）*年*月*日
接收单位意见：
接收单位负责人：
单位（公章）*年*月*日
八、评审专家组意见
表决结果
（通过或不通过）
建议资助金额（万元）
评审专家组组长签字
12
篇3：生物化学实验报告-蛋白质分子量测定--凝胶层析法等
生物化学实验报告-蛋白质分子量测定--凝胶层析法等 本文关键词：层析，分子量，凝胶，测定，蛋白质
生物化学实验报告-蛋白质分子量测定--凝胶层析法等 本文简介：生物化学实验报告姓名：专业：院系：学号：实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法1、实验原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过
生物化学实验报告-蛋白质分子量测定--凝胶层析法等 本文内容：
生物化学实验报告
姓名：
专业：
院系：
学号：
实验一
蛋白质分子量测定------凝胶层析法
1、
实验原理
凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。
以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后，柱床总体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。
洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：
Ve=Vo+KdVi
式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无光，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成：
Kd=(Ve-Vo)/Vi
上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出；Vi可由g.Wr求得。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。
Vo表示外体积；Vi内体积；VeII、VeIII分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况：
1、
当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质，洗脱体积等于空隙体积。
2、
当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和。
可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd等于1，它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。
3、
当01时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve>Vo+Vi。例如一些芳香化合物的洗脱体积远超过理论计算的最大值，这些化合物的Kd>1。如苯丙氨酸，络氨酸和色氨酸在Sephadex
G-25中的Kd值分别为1.2,1.4和2.2。
在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合牢固，称为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以g.WR计算，此为也常有直接用小分子物质D2O,NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一个解决的办法是不使用Vi与Kd，而用Kav代替Kd，其定义如下：
已知
Kd=（Ve-Vo）/Vi,Vt-Vo代替Vi,则：
Kav=（Ve-Vo）/(Vt-Vo)
即
Va=Vo+Kav(Vt-Vo)
在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相，，而洗脱剂（Ve-Vo）作为流动相。Kav与Kd对交联的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。
Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：
Ve=K1-K2logM
K1和K2为常数，M为分子量，Ve也可用Ve-Vo,Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同，通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，，称为“选择曲线”。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征，在允许的工作范围内，曲线逾陡，则分级逾好，而工作范围逾窄。凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有自己得特殊的选择曲线，可用以测定未知的分子量，测定时以便用曲线的直线部分为宜。
用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分，然后测定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在PH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端PH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。用凝胶层析法所测得分子量的结果，要和其他方法测定相对照，由此可以得到可靠的结论。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和，一般不引起生物活性的变化，目前得到广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热源动物以及用于测定高分子物质的分子量。
二、实验步骤
1、
将实现准备好的凝胶缓慢的注入层析柱中，注意连续加入凝胶不要使凝胶柱出现断层，凝胶柱中不能出现气泡；
2、
待层析柱中凝胶注满后，计算每分钟层析柱下滴液体的滴数，调节液滴下滴速度，再计算液滴滴满2ml时所用的时间，记下该时间；
3、
加样。用胶头滴管吸取0.8ml样品（蓝色葡聚糖酶，牛血清酶，胃蛋白酶，细胞色素C）缓慢的滴入层析柱内凝胶的表面，上面用洗脱液灌满，同时打开蛋白质核酸层析仪，设定好收集满2ml液滴所用时间。记下依次加入样品时所收集的洗脱液的体积。
4、
测定收集的洗脱液在280nm时的吸光值
5、
以洗脱体积为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制选择曲线。
3、
实验结果
1、
吸光度测定结果
表
1
第一次加样
第二次加样
第三次加样
第四次加样
编号
吸光度
编号
吸光度
编号
吸光度
编号
吸光度
编号
吸光度
编号
吸光度
1
0.043
7
0.195
13
0.051
19
0.07
25
0.039
31
0.068
2
0.053
8
0.446
14
0.114
20
0.049
26
0.049
32
0.049
3
0.059
9
0.134
15
0.121
21
0.041
27
0.099
33
0.037
4
0.064
10
0.063
16
0.067
22
0.039
28
0.189
5
0.06
11
0.064
17
0.067
23
0.04
29
0.201
6
0.065
12
0.055
18
0.151
24
0.037
30
0.128
2、绘制洗脱曲线
以洗脱体积为横坐标，OD值为纵坐标绘制洗脱曲线如下。
图
1
3、绘制标准曲线
表
2
Ve
OD
M
lgM
4
个
峰
值
16
0.446
200
2.30103
30
0.121
67
1.826075
36
0.151
36
1.556303
58
0.201
13.7
1.136721
以蛋白质分子量的对数lgM为横坐标，Ve为纵坐标，绘制标准曲线如下。
图
2
4、
实验结果分析
1、实验过程中加样是很关键的步骤，加样太快容易造成重叠峰。
2、
洗脱曲线四个峰值明显，表明四种蛋白质样品被有效的分开。
3、
A样和B样，C样和D样之间洗脱体积差异不太大，有可能是后一个样加样时间提早了得缘故，致使两峰值之间的间距较小，会有分离不出，两峰重叠的可能。
4、
根据蛋白质摩尔质量的对数和洗脱体积所作的标准曲线不是一条直线，可能是洗脱体积的误差。如果在实验过程中，收集洗脱液时出现气泡，会严重影响洗脱体积的计算，造成洗脱体积的计算不准确，从而造成误差。蛋白质分析仪也有可能造成机械误差。
5、
从标准曲线看出，蛋白质的分子量所对应的洗脱体积偏小，最有可能造成的误差就是在洗脱蛋白质时出现气泡。为解决这一问题，可以多测量几次洗脱体积，取品均值后再作图案，可以减小误差。
实验二
小麦种子储藏蛋白—HMW-GS的分离（SDS-PAGE）
一、实验目的
利用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）研究小麦种子储藏蛋白C高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）组成结构。此外，SDS-PAGE也是测定蛋白质亚基分子质量的常用方法。通过本实验，掌握SDS-PAGE的基本原理、技术及应用。
二、实验原理
用十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（巯基乙醇或二流苏糖醇）热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键被还原，解离的亚基与SDS发生定量结合后使得蛋白质亚基带上大量负电荷，从而掩盖了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异。亚基的构象均呈长棒状，各种蛋白质亚基-
SDS复合物表现出相等的电荷密度，在电场中迁移速度仅与分子量有关。因此，SDS-PAGE可以用来分离蛋白质亚基并测定其分子质量。
三、实验器材及试剂
1.仪器
电泳仪、垂直板电泳槽、台式高速离心机、脱色摇床、加样枪、烧杯50ml
2个，移液管
2.试剂和材料
70%乙醇、50%正丙醇（含2%β-巯基乙醇）250ml、样品提取缓冲液、样品提取液、30%丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺、分离胶缓冲液（Tris-HCl）pH8.8、浓缩胶缓冲液（Tris-HCl）pH6.8、10%AP溶液、染色液、漂洗液
四、操作步骤
1、样品的提取
（1）取一粒种子研磨粉碎，加入70%乙醇1000ul，10分钟后，12000转离心8分钟；弃乙醇晾干。
（2）加50%正丙醇（含2%β-巯基乙醇）250ul混匀后，50℃水浴1.5小时，中途需震荡，12000转离心8分钟。
（3）取上清夜加3倍体积丙酮置于-20℃＞3小时。
（4）12000转离心8分钟，倒掉丙酮晾干，加提取液250ul，待溶解完全后，在沸水浴煮沸2.5分钟，之后12000转再离心1分钟，上清液用于点样。
2、SDS-PAGE分析
（1）组装电泳槽：见电泳槽使用说明书
（2）凝胶的制备：
取两只干净烧杯（500ml）标号，按下表试剂配方惊醒制胶。在组装好的电泳槽中先制分离胶，待分离胶聚合后，倒掉乙醇溶液，再灌浓缩胶，灌好浓缩胶后迅速插入样品梳静置聚合。分离胶用量15ml，浓缩胶用量5ml。
表1
凝胶的制备试剂配方
聚丙烯酰胺凝胶组成
分离胶（10%）
浓缩胶（3%）
30%Acr-Bis（ml）
H2O
pH8.8Tris-HCL(含SDS、TEMED)（ml）
pH6.8
Tris-HCL(含SDS、TEMED)（ml）
10%AP（ul）
2.5
2.95
2.0
0
100
0.62
3.0
0
1.3
75
（3）加样及电泳
待凝胶聚合完全后，拔掉电泳梳子，然后将电泳槽注满电泳缓冲液，取适量上清液加样，在标准泳道点是上高分子标准蛋白质溶液。上槽接负极，下槽接正极，恒流200mA电泳。待溴酚蓝走出分离胶后30分钟停止电泳，取出玻璃板，剥胶染色。
（4）染色
剥下的胶用蒸馏水洗涤后加入染色液，盖上盖子，放入微波炉低温染色4次，每次1分钟，取出震荡，取出。
（5）脱色
将染色液倒回瓶内，加入漂洗液洗，漂洗两次，每次1-2小时，照相保存。
五．实验结果分析
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得到四条大小不同的条带分离出蛋白质亚基并可知道其亚基的分子量，条带不是很平整可能是梳子没有插好，导致点样不好，也可能是本身做胶就不够好，使得条带不够整齐清晰。
实验三
猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定
一、实验目的
通过本次实验熟悉掌握超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化方以及SOD活力的测定。
二、实验原理：
超氧化物歧化酶（SOD）是一种能专一地清除超氧阴离子自由基（O2-）的金属酶,它具有抗衰老，抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业具有广泛的应用前景。
SOD是一种酸性蛋白，对热、PH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它含的金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫色；Fe-SOD呈黄褐色。
SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内O2-的含量的相对平衡。机体内O2-的形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。在某些疾病过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为H2O2，而过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。
本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可以用一下方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。
该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应溶液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化率达50%的酶量定义为一个酶活单位。
样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈蓝色。在一定的范围内，溶液在595nm波长下光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，在测定范围1-1000ug。
SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离。用“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮唑蓝（NBT）由黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，经电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处显色为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱。
三、
操作步骤
1、
SOD的提取
（1）
取新鲜猪血20ml（预先按0.5:1的比例加入ACD抗凝剂），4000r/m，10min，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，并量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min，弃上清液，得洗净的红血球浓稠液。
（2）
向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%的乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，均匀呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样2ml。然后将清液在65-70°C恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至室温，4000r/m，5min，除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样2ml。
（3）
向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置4h，4000r/m，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积的丙酮溶液洗二次，离心收集沉淀，自然干燥既得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，备用。
2、
SOD活力测定
（1）邻苯三酚自氧化率的测定
取4.5ml
50mmol/L
PH
8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml
10mmol/L
EDTA-Na2溶液，混匀后在25°C水浴保温20min，取出后立即加入25°C预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/L
HCl作空白，325nm波长下每隔30s测定光密度值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在0.07/mim左右。
（2）
酶活力测定
操作与（1）基本一致，加入邻苯三酚前，先加入0.1ml的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光密度值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。
（3）酶活性单位的计算
根据酶活单位定义，按下列公式计算酶活性：
单位活性（U/ml）=(((A0-Am)/A0*100%)/50%)*反应液总体积数*（样液稀释倍数/样液体积）
总活性（U）=单位活性测定*酶原液总体积
（4）蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）
标准曲线的制作：取6支试管，编号，按下表加试剂：
表1.各试管加样量及对应蛋白质含量
试剂
管
号
1
2
3
4
5
6
蛋白质标准液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝G-250(ml)
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量（ug）
0
20
40
60
80
100
盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。在595nm波长下比色测定光密度，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白含量（ug）为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。
样品中蛋白含量的测定
将待测的SOD溶液并稀释到一定浓度，取1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。
蛋白质含量计算
根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含
量，计算其浓度。
3、
实验结果
1.测得邻苯三酚自氧化率：
表
3
时间(min)
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
A
0.018
0.060
0.098
0.134
0.167
0.200
0.232
0.261
图
3
计算得：A0=0.069/min。
酶活力测定中三个不同量样液的光密度值见下表：
表
4
时间(min)
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
样1(50μl)
0.208
0.217
0.225
0.232
0.242
0.249
0.258
0.264
样2(100μl)
0.068
0.073
0.079
0.084
0.088
0.093
0.099
0.104
样2(100μl)
0.051
0.053
0.054
0.055
0.057
0.061
0.062
0.064
计算（方法同1）得：
A1=0.016/min；A2=0.0103/min；A3=0.004/min。
酶活性单位的计算：
单位活性（U/ml）=
表
5
样液体积(ml)
酶原液总体积(ml)
Am
单位活性(U/ml)
总活性(U)
样1
0.05
14
0.016
314.8936
4408.511
样2
0.1
12.5
0.0103
172.6064
2157.58
样3
0.1
5
0.004
189.3617
946.8085
（1）
标准曲线的制作
表4.标准曲线制作各试管加样量及光密度值
试剂
管
号
1
2
3
4
5
6
蛋白质标准液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝G-250(ml)
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量（ug）
0
20
40
60
80
100
光密度值（A595）
0
0.174
0.341
0.452
0.620
0.729
图2.蛋白质含量标准曲线
（2）
样品蛋白质含量
样品光密度测定值及蛋白质含量的计算结果如下表：
表
6
样号
A595平均值
蛋白质含量(μg)
蛋白质浓度(μg/μl)
样1
0.287
36.63186
1.8316
样2
0.171
19.17618
0.1918
样3
0.1185
11.27598
0.1128
（3）
数据处理
表
7
提纯步骤
酶液总体积ml
蛋白质mg/ml
酶活性U/ml
总活性U
比活性U/mg
回收率%
纯化倍数
除血蛋白上清
14
1.8316
314.8936
4408.51
171.92
100
1
热变性后上清
12.5
0.1918
172.6064
2157.58
899.93
48.94
5.23
丙酮沉淀后
0.0117(g)
0.1128
189.3617
946.81
1678.74
21.48
9.76
4、
实验结果分析
1、
蛋白质含量标准曲线不是一条直线，可能是由于分光光度计的读数误差，也有可能是认人为误差。解决方法，可以多次测量取平均值，再舍去离标准曲线较远的点，使标准曲线两边的点数目尽量一样多，再绘制标准曲线，这样就可以减少偶然误差。
2、
样品一的蛋白质含量过高，从后面的电泳图也可以看出样品1混有杂质，说明分离SOD同工酶时细胞可能有溶血。里面含有杂质，所以吸光值较大在标准曲线上所对应的蛋白质含量就过高，所以样品1的蛋白质含量不准确。
3、
表3中邻苯三酚的自氧化率没有达到0.07/mim,可能会对后续实验结果造成影响，最大的影响就是使得所测样品中SOD同工酶抑制邻苯三酚的自氧化率会减小，从而计算出来的酶活性相应减小。
4、
本实验纯化过程中，蛋白质含量、酶总活性逐渐降低，比活性逐渐增加。而酶活性本应随着酶纯度的增加而增大，但本实验没有这样的现象。SOD纯化倍数逐渐增加，最后达到约10倍，但是回收率却只有21%，偏低。说明本实验还存在很多问题，在操作时需要注意。
20