抗癌的吲哚酚类通过抑制硫氧还原蛋白酶和活化信号的氧化还原来诱导人胰腺癌细胞的凋亡论 本文关键词：吲哚，蛋白酶，胰腺，癌细胞，活化
抗癌的吲哚酚类通过抑制硫氧还原蛋白酶和活化信号的氧化还原来诱导人胰腺癌细胞的凋亡论 本文简介：抗癌的吲哚酚类通过抑制硫氧还原蛋白酶和活化信号的氧化还原来诱导人胰腺癌细胞的凋亡摘要：吲哚酚类研制成为潜在的抗人胰腺癌的因子。通过测定IC50，IQs在低纳摩尔浓度下就表现对胰腺癌细胞系MIAPaCa-2强有力的抗癌活性。IQs50诱导的细胞凋亡是时间和浓度依赖性的，而且和其他浓度依赖的抑制剂诱导生
抗癌的吲哚酚类通过抑制硫氧还原蛋白酶和活化信号的氧化还原来诱导人胰腺癌细胞的凋亡论 本文内容：
抗癌的吲哚酚类通过抑制硫氧还原蛋白酶和活化信号的氧化还原来诱导人胰腺癌细胞的凋亡
摘要：
吲哚酚类研制成为潜在的抗人胰腺癌的因子。通过测定IC50，IQs在低纳摩尔浓度下就表现对胰腺癌细胞系
MIAPaCa-2
强有力的抗癌活性。IQs50诱导的细胞凋亡是时间和浓度依赖性的，而且和其他浓度依赖的抑制剂诱导生长抑制的影响而言，IQs是MIA
PaCa-2细胞中硫氧还原蛋白酶1（TR1）的强有力的抑制剂。TR1通过IQs而被抑制的机制在无细胞体系中用纯化的酶做具体的研究。使用液相色谱
-
串联质谱法分析发现，TR1的C-末端硒代半胱氨酸被认为是IQ衍生出来的活性亚胺的主要内收位点。通过IQs，在MIA
PACA-2细胞中，TR1的抑制导致了硫氧还蛋白-1的氧化还原状态转变为氧化形式以及活化p38和c-Jun
NH2-末端激酶（JNK），促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。氧化的硫氧还蛋白被认为激活了细胞凋亡信号调节激酶1——是在MAPK信号级联中的p38/JNK上游活化酶，这些已经在研究中被证实，从而提供了Q-诱导的细胞凋亡的潜在机制。这些数据描述了在人胰腺癌细胞系中的氧化还原以及参与了被TR1的新型抑制剂诱导的生长抑制机制的信号事件。
引言：
之前我们已经报道了一系列新型吲哚酚类的发展，在胞内胞外，它们都表现出对人胰腺癌细胞明显的生长抑制(Yan
et
al.,2009)。这些化合物共有吲哚酚类的骨架结构，但是在醌环和吲哚环上有不同的取代。两类IQs被发现是对各种人胰腺癌细胞系极其有效的药物，达到IC50的生长抑制时是在低的纳摩尔浓度范围，这两类即为2-羟甲基类（例如2-羟甲基-5-甲氧基-1-甲基-3-[(4-硝基苯氧基)甲基]吲哚-4,7-二酮（1）；Fig.1]
和2位未取代的吲哚酚类【如，5-甲氧基-1-甲基-3-【(2,4,6-三氟苯氧基）甲基】吲哚-4,7-二酮（2）；Fig,1】。
(Yan
et
al.,2009)。在NCL-60肿瘤细胞系培养中，两类分子都表现出一种细胞毒性的模式，这表明，对结肠癌，肾癌和黑色素瘤细胞系，两类分子都有优先的毒性模式(Yan
et
al.,2009)。IQs的NCI-60作用模式和先前报道硫氧还蛋白还原酶抑制剂4
-（苯并噻唑-2
-
基）-4
-
羟基-2,5
-
环己二烯-1
-
酮（AW464）的相似处（Chew等人，2008），引起一个猜想——人硫氧还蛋白系统可能是IQs的分子靶。
细胞质硫氧还蛋白系统，包括硫氧还蛋白-1，硫氧还蛋白还原酶1（TR1），和NADPH，在维持细胞内的蛋白的硫醇的氧化还原平衡中（Arne
r和Holmgren说，2006年）中发挥核心作用。
硫氧还蛋白系统具有用于细胞功能所必需的许多生物活性。
首先，硫氧还蛋白参与抗氧化防御，主要通过作为对硫氧还蛋白过氧化物酶的电子供体，用巯基以清除氧化剂
(Berggren
et
al.,2001).
其次，降低的硫氧还蛋白使得核糖核苷酸还原酶的相等的降低量，核糖核苷酸还原酶催化核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸（洛朗等人，1964），是DNA合成和细胞增殖的关键步骤之一。
第三，硫氧还蛋白调节转录因子结合DNA的活性，如糖皮质激素受体，转录因子IIIC，
核因子-B，p53和激活蛋白-1（FOS/Jun）,通过他们的DNA结合结构域处的半胱氨酸残基的氧化还原调控来实现。
(Cromlish
and
Roeder
1989;
Grippo
et
al.,1983;Abate
et
al.,1990;
Matthews
et
al.,1992;
Ueno
et
al.,1999).
最后，对于IQs的凋亡作用也是最重要的，降低硫氧还蛋白可能通过结合到细胞凋亡信号调节激酶1（ASK1）然后抑制其激酶活性，作为细胞凋亡的抑制剂。
从ASK1中，硫氧还蛋白氧化的解离导致ASK1激活和下游的细胞凋亡(Ichijo
et
al.,1997;Saitoh
et
al.,1998).
我们之前的研究表明靶位点TR1可能是引起IQ毒性的潜在机制。在这项研究中，我们在人胰腺癌细胞中阐明了TR1作为IQs的靶位点。在无细胞和细胞系统中，这些IQs都抑制了TR1，导致通路级联的活化，包括ASK1和P38/JNK
MAPKS的信号通路。这些结果描述了在人胰腺癌细胞中的氧化还原和与IQs毒性机制相关的信号通路。
材料和方法
材料：
1）2-羟甲基-5-甲氧基-1-甲基-3-[(4-硝基苯氧基)甲基]吲哚-4,7-二酮（1）；5-甲氧基-1-甲基-3-【(2,4,6-三氟苯氧基）甲基】吲哚-4,7-二酮（2）；】被合成
2）
重组人NRH:醌氧化还原酶2（NQO2）自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州）得到。
3）
核苷（NRH）合成在我们的实验室中使用发布程序（。Friedlos等，1992;燕等人2008年）
4）
重组小鼠TR1从IMCO
Corporation
Ltd购买
5）
TR1的抗体，磷酸化ASK1，全部ASK1从Santa
Cruz
Biotechnology
(Santa
Cruz,获得
6）
抗硫氧还蛋白-1，磷酸化p38（Thr180/
Tyr182）和磷酸化JNK（Thr183/
Try185）从）Cell
Signaling
Technology
(Danvers,MA)获得
7）
细胞色素c的抗体是从BD
Pharmingen
(San
Diego,CA)购买
8）
P38抑制剂4-（4-
氟苯基）-2
-
（4
-
甲基亚磺酰苯基）-5
-
（4
-
吡啶基）1H-咪唑
（SB203580）和JNK抑制肽L-JNKi购自Enzo
Life
Sciences,Inc.
(Plymouth
Meeting,PA)，PA）。
9）
转染质粒转染pCMV-SPORT6-ASK1从
Open
Biosystems
(Huntsville,AL)购买（亨茨维尔）。
10）
膜联蛋白V染色试剂盒和EnzChek荧光Caspase-3活性试剂盒购自Invitrogen公司（卡尔斯巴德获得，CA）中。
11）
除非指明，所有其它化学品购自
Sigma-Aldrich公司
细胞系和转染。
1）
MIA
PACA-2人胰腺癌癌细胞从
American
Type
Culture
Collection
(Manassas,VA)获得。
2）
细胞培养于Dulbecco改良的
的Eagle培养基，调节至含有4mM的L-谷氨酰胺，10％（体积/体积）胎牛血清，2.5％（体积/体积）马血清，100单位/
ml青霉素，和100微克/毫升链霉素。细胞保持在湿润的培养箱中含有5％二氧化碳，37℃。
3）
对于瞬时转染
研究，MIA
PACA-2细胞通过电穿孔转染
含有ASK1基因的人类巨细胞病毒驱动载体pCMV-SPORT6或单独的载体。
4）
然后将细胞在完全生长培养基中温育16小时，之后再用IQs处理
生长抑制试验
1）使用生长抑制测定的MTT比色分析法（参见Mosmann，1983）
2）在这些研究中，将对数期的细胞以每孔2×10^3个细胞接种到96孔板，一式三份，并且使得贴壁16h。
3）然后用含有IQs的完全培养基（200微升/孔）处理72小时或治疗为4小时无药物的培养基孵化后，接着培养在药物培养基，37℃额外72小时。
4）去除培养基，50微克MTT添加到50微升的完全培养基后，添加到每一孔中，再孵化4小时。
5）细胞存活率通过测量来确定MTT还原成结晶甲臜的产物，加入100微升DMSO讲产物溶解。
6）光密度在使用Thermomax酶标仪550nm波长测定
(Molecular
Devices,Sunnyvale,CA).
7）IC
50值被定义为IQ的浓度——与对照组相比，导致降低了50％的细胞数的浓度。
细胞凋亡的流式细胞仪检测
1）
细胞（4×10^5）分别接种到60毫米的培养皿。药物处理后，将细胞收集，用PBS洗涤，重悬在膜联蛋白结合缓冲液和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和PI中，根据厂商的说明。(Biosource
Annexin
V
detection
kit;
Invitrogen)
2）
膜联蛋白V和PI染色使用FACSCalibur流式细胞仪进行分析
(BD
Biosciences,San
Jose,CA)。细胞被阳性膜联蛋白-V染色的计为凋亡细胞。
caspase-3活性测定
1)
caspase-3的活性测定使用EnzChek
caspase-3的测定按照试剂盒（Invitrogen公司)制造商的说明。简言之，将细胞收集到的裂解缓冲液和超声处理，细胞裂解物中的胱天蛋白酶-3活性用荧光测定通过以下所述基板的切割所测量?-苄氧羰基-DEVD-氨基-4
-
甲基香豆素。
线粒体细胞色素c释放
收获细胞并重新悬浮在透化缓冲液（200微克/毫升的毛地黄皂苷和
80mM的氯化钾溶于PBS中）。
5分钟后，在冰上温育后，将样品
以1000g离心5分钟。上清液（细胞质部分）转移到紧接新管和沉淀（线粒体）再悬浮在RIPA缓冲液。这两个分数都那么进行免疫印迹细胞色素C的分析。蛋白质含量采用Lowry等人的方法进行测定。
（1951）。
无细胞体系TR1的抑制作用
1）抑制反应进行在100mM磷酸钾缓冲液，pH7.4，含有2mM
EDTA和1毫克/毫升的牛血清白蛋白。
2）0.5微mol重组大鼠TR1，250微mol的NADPH，2微mol的NQ02，和200微mol的NRH的混合物在上述缓冲液中孵育，在室温温度下保持5分钟。
3）
然后，不同浓度的IQs分别为加入（该混合物的终体积为150微升），30min内，每5分钟取20
微升样品，测量
TR1活性，采用DTNB还原法，如先前所描述的（Fang等人，2005）。
4）
活性测定混合物含有100mM的磷酸钾缓冲液，pH7.4，2mM
EDTA的，1毫克/毫升牛血清白蛋白，250
M
+
NADPH和2.5mM的DTNB。TNB从DTNB的释放的测定是加样品测定1分钟内412nm的吸光值，计算速度。
5）
一个空白的读数没有添加样品的样本
6）
结果表示为对照的百分比（20微升，加入IQs前取出样品），并分别代表三个独立的实验。
用质谱分析技术检测在TR1中IQs修饰的残基
1）分别进行LC-MS/
MS实验，用出版方法（善达等人，2006）进行细微的修改。
2）40微升溶液中包含了50mM
磷酸钾缓冲液，pH为7.4，1mMEDTA,0.5g的NQO2，200微末NRH,9g的TRQ,250微摩NADPH，在室温下孵育15分钟。
3）
加入1微升的溶解在DMSO的4mM
IQs，混合物再孵育30分钟
4）
将反应体系中的蛋白质在6微M盐酸胍，在70℃下进行30分钟。
5）
变性的蛋白质中的半胱氨酸残基，然后通过二硫苏糖醇还原其次是碘乙酰胺烷基化被修饰。
6）
样本分别用50mM
NH
4
HCO3稀释10倍，分离以
1:50胰蛋白酶/蛋白质比在37℃下过夜。
7）
消化产品使用SpeedVac中（默飞世尔科技，沃尔瑟姆干燥，
MA）和重新溶解在0.1％三氟乙酸。
8）
约10
皮摩尔的TR1消化物的使用ZipTip
C18的设备纯化，然后洗脱到10微升50％乙腈和0.1％三氟乙酸的在纯水中。
9）
使用正离子电喷雾电离液相色谱
-
串联质谱（LC-MS
/
MS），Agilent
1100毛细管
高性能液相色谱系统接口到飞行时间型的四极质谱仪（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州）
配备了PicoView纳流源（新的目标公司，马萨诸塞州沃本）。分析纯化的胰蛋白酶。
10）
样品采用纳米注射器手动注入
（瓦尔科仪器有限公司，休斯顿，德克萨斯州）到1.0，150毫米18的MS柱（格雷斯性Vydac，Hesperia的，CA）。
11）
16分钟从3%至80％溶剂B（A，0.1％甲酸：B，90％乙腈/
0.1％甲酸）
使用在350升/分钟，在3％的B的第一分钟，随后通过线性增加至40％B，在9分钟，最后保持在80％B
3
min
.
12）光谱用Waters四极杆飞行时间质谱仪以正模式记录。扫描光谱范围为全扫描，设置为400~2000。
肽碎片谱的自动分析（MS
/
MS）基于MASCO进行（矩阵科学，伦敦，英国）的计算机算法进行蛋白质数据库搜索和蛋白质鉴定。
使用ProteinProspector计算的C-末端肽的理论同位素的分布
细胞中TR1活性
1）
将细胞收集到的RIPA缓冲液中，
超声处理，然后离心（13000
rpm离心?15分钟），在上清液中的蛋白质的浓度用洛瑞的方法求得
2）
然后在96孔板中进行TR1活性测定，利用一个端点胰岛素减少测定法如先前所述（Fang等人，2005）。简而言之，反应（50微升）中含有50
mM的Tris-HCl，pH值7.4，2
mMEDTA，200微m的NADPH，1.5毫克/毫升
胰岛素，20
M
+大肠杆菌硫氧还蛋白（Sigma公司），和40微克的蛋白从各细胞提取物。温育20分钟，在37℃后，
终止反应，加入200升的1
mM的DTNB在6M的胍盐酸盐（溶解于50mM的Tris-HCl，pH
8.0）中。
3）
该游离硫醇在降低胰岛素通过DTNB还原，测定吸光度在412nm处，其中1摩尔二硫化物的产生2摩尔游离TNB与消光系数13.6mM1
cm1。。空白测定各样品，含一切除硫氧还蛋白，以相同的方式进行处理，从相应的样品的值吸光度中减去并空白值。
TR1的活性表示为DMSO处理的对照的百分比。
谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性测定
1）
在细胞中谷胱甘肽还原酶（GR）的活性测定使用先前描述的方法（Gromer等人，1998）。该测定混合物（1ml）溶液由100mM磷酸钾，pH
7.0，2mM
EDTA的，和100微
M
+
NADPH。
细胞超声波处理后，NADPH的消耗相当于在340nm处吸光度的减少，在1
mM的GSSG的存在或不存在的情况下。
GR活性是通过计算在OD340加上或去掉GSSG的速率减少的差异。细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶（谷胱甘肽过氧化物酶）活性的测定与GR偶联的途径测定如前所述（Gromer等人，1998）。该法混合物（1ml）中含有50mM磷酸钾，pH8.0，1
Mm
EDTA，1单位/
ml
GR，1mM
GSH和200微m的NADPH，
平衡5分钟;加入细胞超声处理物并孵育1
分钟。然后，加入基板叔丁基过氧化氢（终浓度1
毫摩尔）到溶液，在340nm处测定NADPH的消耗。
GSH/
GSSG系数的测定
在解冻前将冷冻细胞沉淀物（2×10^6）之前在150微L冰冷的0.1N高氯酸中的超声处理，以防止在制备过程中人为形成巯基二硫化物。
匀浆物在4℃下，14000g离心力下离心15分钟。GSH和GSSG在上清液中的水平用高效液相色谱法所报告
，然后通过Lowry等人的方法，标准化为蛋白（1951）。
细胞总非蛋白巯基
细胞中的总酸，可溶性硫醇依照发表的方法（确定塞德拉克和林赛1968年）。细胞（2×10^6）收集到冰冷的PBS及分成两管。然后将细胞在1000g离心力下离心5min沉淀。在一个管中的细胞沉淀重悬在RIPA
缓冲液中，用于测定蛋白质浓度，采用
Lowry等的方法。
（1951）。在另一个管中的细胞沉淀物溶解于120
微升的5％三氯乙酸，立即涡旋10秒，然后以5000rpm离心10分钟以沉淀细胞蛋白。该上清液移至玻璃管中，玻璃管中含2ml的0.4m
Tris-HCl，pH值8.9，DTNB加至终浓度
100微摩尔。样品涡旋并温育5分钟，在室温
温度，和吸光度412nm处进行测定。
结果表示为每毫克蛋白质中的微摩尔的酸可溶性硫醇，通过还原性谷胱甘肽校正曲线计算。
细胞中硫氧还蛋白氧化还原状态的测定
硫氧还蛋白在细胞的氧化还原状态，如前所述方法确定（Sun
and
Rigas
2008）。简言之，将细胞收集到新鲜制备的裂解缓冲液（50mM的Tris-HCl，pH值8.3，2mM
EDTA的加入6M胍盐酸盐，0.5％的Triton
X-100，和50mM碘乙酸），然后在黑暗中于37℃下进行30分钟。细胞裂解物再纺通过脱盐柱（微生物旋转;
Bio-Rad实验室，赫拉克勒斯，CA），蛋白质浓度的测定使用
Lowry等人的方法。
（1951）。脱盐蛋白（50微克）由15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜。还原的和氧化的硫氧还蛋白-1的探测用兔抗人thioredoxin-
1抗体，并使用增强的化学发光检测。
免疫印迹分析
细胞接种在100mm的培养板，每板10^6个细胞，并用各种浓度的IQs处理,用时间作为数据的表征。
细胞收集在RIPA缓冲液补充了蛋白酶抑制剂cocktail（罗氏诊断，印第安纳波利斯，IN）和磷酸酶抑制剂混合物（G-Biosciences公司，圣路易斯，密苏里州）。
然后将细胞超声波处理并离心（13000
rpm离心?15分钟），并且该蛋白质上层清液的浓度，用该方法为洛瑞。细胞蛋白（50微克），然后用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏二二氟乙烯膜。然后将膜与探测对磷酸化p38（Thr180/
Tyr182），磷酸化的初级抗体JNK（Thr183/
Try185），磷酸ASK1（Ser83），和β肌动蛋白的抗体，二抗为通过辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白（杰克逊免疫研究实验室，西树丛，PA）。检测Western印迹信号用增强的化学发光Western印迹检测试剂
（通用电气医疗集团，查尔方特圣吉尔斯，白金汉郡，英国）。所有显示的印迹是代表三个独立的实验。
统计分析
使用进行统计分析单向方差分析后适当的事后检查：Dunnett检验多个观测比较单一
控制;学生的t检验进行两两比较。数据被表示作为意思
S.D.的至少三个重复实验。
结果
用于这项研究的IQs
一系列的IQs用我们以前的研究被筛选，可作为对潜在的抗胰腺癌药物（Yan等，2009）。在当前的研究中，两个引入化合物（图1A），IQ化合物1和2，被选定为研究IQs对胰腺癌细胞的作用机理。IQs的作用机制图示于图1B，包括IQs的氧化还原，排出的离去基团，亲电子的产生的烷基化物种（图1B）。人类TR1，其中有一个C末端的活性位点硒代半胱氨酸残基，被认为是IQs的潜在目标。
IQs对人胰腺癌的生长抑制活性
在MIA
PACA-2胰腺癌细胞系用MTT法对IQs
1和2对人胰腺癌细胞生长的影响的评估。
这两种IQs表现出明显的生长抑制活性，IC
50值在低纳摩尔范围内的。在MIA
PACA-2细胞的IQ1的IC
50值在4和72小时处理后分别为96和74nM
;在4和72小时处理后，
IQ2的IC
50值分别为35和
18nM。该生长抑制的活性也在其他人胰腺癌细胞系PANC-1和胰腺癌BxPC-3被证实两种（数据未显示）。
IQs诱导胰腺癌细胞凋亡
之前我们已经报道了IQ1在1
MIA
PACA-2中诱导caspase依赖的凋亡细胞。在目前的研究中，我们证实了MIA
PACA-2细胞凋亡上剂量依赖性的增加，无论是被IQ1或2的处理18h后，在浓度范围大致相对于MTT的IC
50值
（图2，A和B）。IQs处理后的凋亡事件的详细时程也在MIA
PACA-2细胞探究；线粒体
中的细胞色素c释放到细胞质中，在药物处理2~4h后被检测出来（图2，C和D）中，随后在4~6h
caspase-3被激活（图2，E和F），在处理8小时后，细胞凋亡通过膜联蛋白V染色表现，（图2，E和F）。总之，这些数据显示出的IQs通过蛋白酶的激活和诱导凋亡表现出细胞毒性。这些数据也表明活化线粒体途径是参与细胞凋亡信号传导的关键事件。
在无细胞体系中IQs抑制TR1
因为IQs的激活需要被还原，IQs抑制重组大鼠TR1的能力是在无细胞系统中进行测试
，使用NQO2作为的还原活化工序（IQs测试
并不影响在这些条件下NQO2活动;
NQO2/
NRH本身并不影响这些条件下TR1活性）。
当NADPH还原的TR1被NQO2/
NRH-还原的IQ1或2孵育后，观测到TR1的活性的剂量依赖性抑制的
（图3A）。
抑制是NADPH依赖的（数据未显示），这表明酶的硒代的活性位点参与了IQs的抑制
；抑制也NQO2/
NRH依赖性（数据未示出），这表明与TR1抑制有关的毒性物质的合成是在氧化还原和基团脱去之后。TR1的抑制似乎是不可逆的，因为TR1的酶的使用Millipore公司的分子截留设备脱盐后并没有导致恢复酶的活性（数据未显示）。
TR1的C-末端硒代半胱氨酸作为IQ修饰位点的鉴定
LCMS/
MS法被用来确定IQs的修饰位点。纯化的TR1由IQs孵化，消化，
并进行MS
/
MS分析。如图3C中所示，
肽信号表现出Se同位素分布格局特点被检测出，分子质量是1434.47Da，其对应于该分子TR1的C末端的胰蛋白酶片段加上了IQ1衍生的亚胺中间体和一种碘代乙酰胺的修饰的分子质量。所观察到的同位素分布也与理论分布格局一至，理论的是用
ProteinProspector方案合成的（图3B）。为了确定IQs内收的确切部位，这种肽被MS
/
MS碎裂，产生的光谱（图3D）表明位点是硒代半胱氨酸而不是半胱氨酸残基。这些结果确定了TR1是被IQ衍生的亚胺物质烷基化，从而导致了酶的抑制。
IQs处理TR1的选择性抑制人胰腺癌癌细胞
IQs
1和2的对细胞内TR1的抑制能力在MIA
PACA-2细胞进行测试。
TR1活性是使用端点胰岛素还原活性的测定的。方法在材料和方法中已经描述。
在MIA
PACA-2细胞中的TR1活性抑制作用是剂量依赖，在1小时处理后可以被观测到（图4，A观察到两种化合物和B）。IQ1的TR1抑制的IC50值是146nM，IQ2
的IC50是82nM。
TR1的抑制作用也时间依赖性的，并最大地抑制在1小时处理后出现（图4中，C和D）。最活跃TR1的抑制剂，是金诺芬（Urig和
2006贝克尔）。图4E表明，IQs
在细胞中对于TR1的抑制明显高于金诺芬（高达11倍的效力）。
为了测试IQs选测性的抑制TR1，,与两个密切相关的酶的活性，GR和GPX，在IQ处理的Mia
PaCa-2
cells被测定。
GR有类似与TR1的蛋白结构，但是缺乏缺乏
C-末端硒代半胱氨酸残基（Sandalova等人，2001）。
GPx的是另一种含硒蛋白质，但硒代残基不暴露出来。这两种酶的活性都不受到IQ处理不酶的活性受到IQ治疗浓度的影响，从而成为了，有效的抑制
TR1（图4，A和B）。IQs对GR和GPx的物抑制活性表明，TR1的C末端硒代半胱氨酸，它是10个残基暴露链中的倒数第二个
氨基酸（Cheng等，2009），成为了IQs的靶点。这些数据还表明，在人体胰腺细胞中，IQ化合物是TR1的相对特异性抑制剂。
智商处理对自由基介导的氧化作用
压力，GSH
/
GSSG比率和非蛋白巯基的
人胰腺癌细胞。为了测试是否智商
治疗导致在细胞的任何一般的氧化应激，我们
活性氧测定的细胞水平（ROS）的
通过使用荧光探针二氢乙的指示
及2
，7
-dichlorofluorescein-二乙酸酯，并没有增加
可检测到荧光（数据未显示）。作为间接
氧化应激的指示，细胞总非蛋白
硫醇水平和GSH
/
GSSG比例（参考图1），分别为
还确定，并且观察到在任一指标没有改变
经过药物治疗。此外，智商的到能力
在细胞中诱导氧化还原循环是通过测量评估
氧量（克拉克电极）。智商治疗引起的不
增加氧气吸收在细胞中的速率（数据未
示出）。这些数据表明，在智商没有诱导
显著氧化还原循环和氧化应激在胰腺癌
癌细胞。
IQ处理对Thioredoxin-的氧化还原状态的影响
1人胰腺癌细胞。该thioredoxin-
在MIA中PACA-2细胞1的氧化还原状态后进行了评估
1小时IQ治疗。如根据材料和方法所述，
还原和氧化的硫氧还蛋白1的形式进行分离
通过后，碘天然蛋白质凝胶电泳
酸处理的细胞的蛋白质。如该图所示。
5，
无论是与智商1或2的智商引起剂量依赖性的治疗
增加氧化的硫氧还蛋白-1伴随着下降
在浓度低至100纳米的还原形式（1）
与75纳米（2）。
智商处理对MAPK信号通路的影响
在胰腺癌细胞。智商诱导细胞凋亡
信号被审查MIA
PACA-2细胞后1小时的药物
治疗。治疗用的IQ1或2导致的活化
双方P38和JNK的MAPK的通过增加指示
以剂量依赖性方式磷酸化的p38和JNK的
（图6，A和B）。预处理与P38抑制剂？米），热火显著降低智商诱导的细胞凋亡
PACA-2细胞（图6，C和D）。这个建议，智商
通过机制诱导细胞凋亡在胰腺癌细胞中
涉及两个激活的p38和JNK。